miRNA定量檢測(cè)在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí),其可以形成微小的(平均大小約100-400nm)單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電,可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此miRNA定量檢測(cè)使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱,miRNA定量檢測(cè)一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞?,F(xiàn)存對(duì)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。
對(duì)于miRNA定量檢測(cè),可以采用 RT-PCR,實(shí)時(shí)定量PCR,和Northern Blot等方法進(jìn)行檢測(cè),通過信號(hào)強(qiáng)弱判斷目的基因的沉默效果。值得注意的是在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR時(shí),cDNA合成要用oligo(dT)【oligo(dT),一種引物,cDNA合成zui常用的引物是與真核細(xì)胞miRNA定量檢測(cè)分子3'端poly(A)結(jié)合的12-18核苷酸長(zhǎng)的oligo(dT)】,而不是隨機(jī)引物,且預(yù)擴(kuò)增片段位于靶miRNA定量檢測(cè)序列中siRNA位點(diǎn)的上游,由于功能的執(zhí)行者是蛋白,因此還需要對(duì)蛋白水平進(jìn)行檢測(cè),可通過Western Blot、熒光免疫檢驗(yàn)法、流式細(xì)胞分析術(shù)、ELISA和表型分析等方法來檢測(cè)干擾效果。然而miRNA定量檢測(cè)zui大以及zui終的效果是細(xì)胞的代謝過程、生理生化系數(shù)等表型參數(shù)發(fā)生明顯的變化。
miRNA定量檢測(cè)一般在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)發(fā)生,其引發(fā)基因沉默的程度和持續(xù)時(shí)間依賴于靶蛋白質(zhì)的降解率(turnover rate of the protein) 以及siRNA在細(xì)胞內(nèi)的壽命以及其逐漸被稀釋的程度。由于miRNA定量檢測(cè)是進(jìn)入細(xì)胞后才能對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行抑制,因此如何地將定量檢測(cè)轉(zhuǎn)入細(xì)胞也是成功抑制基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。例如,一個(gè)siRNA分子對(duì)某特定基因的抑制效率為90%,而轉(zhuǎn)染效率為10%,那么zui后抑制蛋白表達(dá)zui后的效率只有9%,可見如何提高miRNA定量檢測(cè)的轉(zhuǎn)染效率非常重要。
1、對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)并檢測(cè)兩到四個(gè)siRNA序列:為了找到潛在靶位點(diǎn),掃描靶基因中的AA序列。記錄每個(gè)AA 3’端19個(gè)核苷酸作為潛在siRNA靶位點(diǎn)。潛在靶位點(diǎn)需通過GENBANK數(shù)據(jù)庫的BLAST分析,去除那些與其它基因明顯同源的靶位點(diǎn)。如果可能,siRNA應(yīng)根據(jù)miRNA定量檢測(cè)低二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域設(shè)計(jì)。
2、選擇低GC含量的siRNA:GC含量在40~55%的siRNA比GC含量在55%以上的siRNA活性高。
3、miRNA定量檢測(cè)純化體外轉(zhuǎn)錄siRNA,在轉(zhuǎn)染前要確認(rèn)siRNA的大小和純度:為得到高純度的siRNA,推薦用玻璃纖維結(jié)合,洗脫(Ambion siRNA體外合成試劑盒中已包括純化柱保證siRNA純度)或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和鹽離子。注意:化學(xué)合成的miRNA定量檢測(cè)通常需要跑膠電泳純化【即聚丙烯酰胺凝膠電泳法(PAGE)膠純化】。
通過體外轉(zhuǎn)錄的方法可以合成miRNA,這樣的成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低,是一種性價(jià)比高的篩選miRNA定量檢測(cè)的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學(xué)合成法更快的得到miRNA。以Silencer siRNA Construction Kit為例,一旦得到DNA Oligo模版(這個(gè)還是需要DNA合成的,不過DNA合成的成本就比較低了),只要24小時(shí)就可以,不需要等很久。這個(gè)方法的不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制,雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的miRNA定量檢測(cè),但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比,還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。畢竟,化學(xué)合成只需要定購就可以了。值得一提的是miRNA定量檢測(cè)通過體外轉(zhuǎn)錄得到的miRNA只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成較高濃度得到的效果。