TA克隆對基因技術(shù)的新進(jìn)展

 　　TA克隆是一種以表達(dá)為基礎(chǔ)的基因分離技術(shù)。它直接用基因組DNA如酵母人工染色體(YACs)捕捉克隆片段，從而達(dá)到快速地從大的基因組區(qū)域分離表達(dá)序列。其主要技術(shù)是用PCR擴(kuò)增來自不同組織的混合TA克隆池或已克隆的克隆文庫，擴(kuò)增的克隆片段與用生物素隨機(jī)標(biāo)記的基因組目標(biāo)DNA雜交，捕獲親和素標(biāo)記磁珠上的與目標(biāo)DNA雜交的克隆片段，然后洗脫磁缽上捕獲的TA克隆并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行第二輪篩選，并將篩選出的克隆片段克隆到載體上。
 
　　TA克隆產(chǎn)物克隆方法的新進(jìn)展,隨著克隆技術(shù)的發(fā)展和普及，克隆克隆產(chǎn)物已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個領(lǐng)域。通?？寺‘a(chǎn)物不具有粘端，只能進(jìn)行平端連接的克隆，且由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩條ＤＮＡ鏈的３'末端加上一個多余的堿基，致使平端連接的效率不高，克隆效率低。改進(jìn)的方法一股是在TA克隆引物的５'端加上限制性內(nèi)切酶識別序列，或是改變引物中ｌ至數(shù)個核昔酸引入限制酶位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的酶處理克隆產(chǎn)物即可獲得粘端，通過粘端的連接，可平端連接通常情況下，TA克隆產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使基因合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，?？傻玫阶懔恐亟M子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將TA克隆產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆克隆產(chǎn)物。引物決定克隆擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性與長度。因此，引物設(shè)計決定PCR反應(yīng)的成敗。
 
　　TA克隆主要是對基因的染色體上具有一定座位的遺傳單位，是DNA分子中一定長度的核苷酸序列。植物的生長發(fā)育是在多種代謝和生理過程基礎(chǔ)上所發(fā)生的基因在時空上表達(dá)的綜合現(xiàn)象，開發(fā)和分離潛在的各種有價值的基因并深入研究其表達(dá)機(jī)理，對作物品種的改良具有重要意義。因此TA克隆對植物基因的克隆并發(fā)展與之相關(guān)的技術(shù)已引起人們的日益關(guān)注和投入，近年來其研究方法不斷改進(jìn)，新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這為進(jìn)一步研究諸如各種調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的基因、逆境與防御反應(yīng)的基因、植物細(xì)胞凋亡的基因等提供了新的途徑。
 
　　TA克隆的操作一般采用兩步法,即*個循環(huán)多以較低的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增,后20個循環(huán)則采用較高的退火溫度擴(kuò)增。TA克隆產(chǎn)物多較短,一般需高濃度的瓊脂糖凝膠檢測,也可用聚丙烯酰胺凝膠檢測。如擴(kuò)增的模板為mRNA,通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度,可以得知該基因在2種生物或同一生物不同發(fā)育階段的表達(dá)強(qiáng)度。另外,在TA克隆檢測到與某一表型相關(guān)的基因或基因產(chǎn)物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整個基因或mRNA。主要操作程序?yàn)?(1)TA克隆產(chǎn)物的提取、克隆及序列測定。首先將克隆檢測到的特定片段從凝膠中切下,提取DNA克隆到適宜的載體內(nèi)(如TA載體),再測定其核苷酸組成。根據(jù)其核苷酸組成設(shè)計2個方向相反的引物(P-1,P-2,見圖2)。引物長度多在20 nt以上；退火溫度在60℃以上；(2)將基因組DNA做適當(dāng)酶切,然后在其兩端連接上相同的接頭根據(jù)接頭的序列擴(kuò)增。